The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations

Geschüttelte Mikrotiterplatten (MTP) sind benutzerfreundlich, preiswert und somit das bevorzugte Kleinkulturgefäß für mikrobielle Screening- und Hochdurchsatzexperimente. Trotzdem wissen die meisten Anwender wenig über die darin herrschenden Kultivierungsbedingungen.

Sauerstofflimitiere Bedingungen können die Effekte der zu untersuchenden Parameter überlagern. Die Selektion suboptimaler Stämme, Medien oder Prozessführungen kann die Folge sein, deren Kompensation in späteren Entwicklungsstadien teuer bis unmöglich ist. 

Um die Sauerstofftransferkapazität (OTR_max) eines geschüttelten Bioreaktors zu erhöhen, kann das üblicherweise runde well Design modifiziert werden. Die hier ausgewählte Publikation beschäftigt sich mit den Effekten von eingefügten Schikanen und anderen Veränderungen der Geometrie auf den OTR von 48-well Mikrotiterplatten.

Die Einfügung von Schikanen kann allerdings Schwierigkeiten wie Spritzen des Mediums, Benetzen der Sterilbarriere und „Ausser-Phase“-Zustände der Flüssigkeit zur Folgen haben.

Auch muss der Füllstand am Boden des wells während des Schüttelns für optische online-Analysesysteme wie den BioLector möglichst hoch sein. Das Gerät führt optische Messungen durch den transparenten Boden der MTP durch, ein möglichst konstanter Füllstand ist dabei unabdingbar.

In dieser Untersuchung werden daher dreißig verschiedene geometrische well-Formen systematisch untersucht, die Schwerpunkte lagen dabei auf der maximalen Sauerstofftransferkapazität sowie der Füllhöhe und dem maximalen Füllvolumen während des Schüttelns (Schütteldurchmesser 3 mm).

Mit Hilfe des Sulfitsystems wurden OTR_max und der spezifische Massentransferkoeffizient (k_La) für verschiedene Schüttelfrequenzen (500 – 1000 rpm) und Füllvolumina (200 – 600 µL) für verschiedene voneinander abgeleitete well-Geometrien bestimmt.

Dabei stellte sich heraus, dass OTR_max eindeutig von der well-Geometrie beeinflusst wird: Die Einführung von Schikanen resultierte bei Schüttelfrequenzen von 800 rpm und bei fast allen Füllvolumina in höheren Sauerstofftransferraten. Die maximale Sauerstofftransferkapazität konnte im Vergleich mit einer konventionellen 48-well MTP durch Schikanen auf mehr als 100 mmol/L/h (k_La > 600 1/h) gesteigert werden

Allerdings führten ausgeprägte Schikanen bei höheren Drehzahlen (> 800 rpm) zu sinkenden OTR_max –Werten, vermutlich durch ein „Außer-Phase“ geraten der Flüssigkeit.

Als biologisches Testsystem für alle 30 Geometrien wurde dank seines hohen Sauerstoffbedarfs (< 110 mmol/L/h für unlimitiertes Wachstum) E. coli K12 ausgewählt. Die Wachstumsrate der Bakterien steigerte sich mit der Ausprägung der Schikanen, somit konnte auch hier der starke Zusammenhang von well-Goemetrie und OTR_max gezeigt werden.

Bei Betrachtung der Füllhöhe im Zentrum des wells zeigte sich, dass ausgeprägte Schikanen Rotation und Hochkriechen der Flüssigkeit an den Wänden bei höheren Drehzahlen verhindern. Wie oben erwähnt ist eine ausreichende Füllhöhe wichtig für eine stabile optische Messung.

Dagegen konnten maximale Füllvolumina von 1300 µL (bei 1000 rpm) nur in annähernd runden wells erreicht werden, ohne dass die Flüssigkeit die Sterilbarriere erreichte. Ausgeprägte Schikanen reduzierten das mögliche Füllvolumen auf 800 µL (33 % des well-Volumens), mit Blumen- und Sternförmigen Geometrien als Ausnahme von der Regel und Füllvolumina bis zu 1200 µL.

Um das ideale Design einer MTP für die aerobe Kultivierung mit online-Monitoring zu finden, musste ein Kompromiss gefunden werden zwischen (i) ausgeprägten Schikanen für eine stabile Flüssigkeitshöhe beim Schütteln, (ii) moderaten Schikanen für ausreichende Sauerstoffversorgung und (iii) kleinen Schikanen, die adäquate Füllvolumina ohne Spritzen der Kulturbrühe ermöglichen.

Die sechsblättrige Blüte mit 5 mm Durchmesser („Flowerplate“) stellte sich als die für die oben genannten Zwecke optimale well-Geometrie heraus.

Mit E. coli K12 wurden in der „Flowerplate“ und Standard-MTPs Kultivierungen bei verschiedenen Füllvolumina direkt verglichen. Die „Flowerplate“-Kultur mit 1200 µL zeigte eine annähernd gleiche Wachstumskinetik wie eine 800 µL Kultur in runden wells (1000 rpm Schüttelfrequenz). Somit können in der „Flowerplate“ etwa 400 µL mehr Kulturmedium geschüttelt werden, bis eine mit der Standard-MTP vergleichbare Sauerstofflimitierung eintritt. 

Das Ergebnis dieser Publikation ist eine systematisch optimierte Mikrotiterplatte als Werkzeug für Screening und Prozessentwicklung mit verbesserter Sauerstoffversorgung, zur Durchführung aussagekräftiger Experimente und Maßstabsvergrößerungen bis zum Rührkessel.